Sprawozdanie z praktyk

Oto tekst sprawozdania, jakie napisałem pod koniec moich praktyk w warszawskim Instytucie Nenckiego. Wybaczcie styl - musiało być w miarę zwięźle i syntetycznie, więc wyszło jak wyszło, ale mam nadzieję, że przybliży to chociaż trochę to, czym zajmowałem się przez blisko dwa miesiące.

Praktyki – wykonane badania:

I. Hodowle pierwotne komórek hipokampa:

Hodowle zakładano z komórek hipokampa pozyskanych od osiemnastodniowych zarodków mysich oraz szczurzych, zgodnie z procedurą opisaną w pracy Culturing hippocampal neurons Bankera. Izolowano mózgi, a następnie hipokampy. Komórki dysocjowano i umieszczono na uprzednio przygotowanych (wyczyszczonych w kwasie azotowym, wysterylizowanych i pokrytych polilizyną) szkiełkach umieszczonych w dołkach płytki 12-dołkowej. Była to hodowla o niskiej gęstości (pomiędzy 50-100 komórek na mm2; większa gęstość mogłaby spowodować tworzenie się agregatów).

W 7 dniu hodowli komórki transfekowano plazmidami kodującymi białko zielonej lub czerwonej fluorescencji (odpowiednio GFP i RFP). Po 24 godzinach komórki utrwalono 4% paraformaldehydem i barwiono metodami immunocytochemicznymi w celu wykrycia markerów komórkowych, takich jak MAP2 (białko cytoszkieletu, występuje w dendrytach), NeuN (białko jądrowe, marker neuronów) oraz synaptofizyna (białko pęcherzyków synaptycznych, marker synaps). Jako przeciwciał drugorzędowych używano między innymi Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555 oraz Texas Red. Następnie komórki oglądano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz konfokalnego, obserwując morfologię komórek.

II. Przygotowanie plazmidu z TIMP1-shRNA:

Przygotowano plazmid kodujący sekwencję shRNA wyciszającą na poziomie ekspresji gen TIMP-1.

Przygotowanie plazmidu obejmowało wklonowanie fragmentu kodującego shRNA do wektora plazmidowego. Następnie wektor namnażano w bakteriach i sekwencjonowano w celu weryfikacji sekwencji wstawki. Szczegółową procedurę opisano poniżej.

Oligonukleotydy z sekwencjami shRNA poddano początkowo procesowi annealingu – po 2 ul każdego z nich dodano do buforu do elucji i umieszczono na ok. 10 minut w temperaturze 99 stopni Celsjusza a następnie schłodzono do temperatury pokojowej, co miało na celu hybrydyzację fragmentów. Następnie poddano je fosforylacji za pomocą ATP oraz kinazy polinukleotydowej oraz ligacji z wektorem (przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza).

W celu dokonania transformacji bakterii należy zwiększyć ich kompetencję, tzn. zdolność do przyjęcia obcego DNA (przepuszczalność błony komórkowej). Można to zrobić, traktując bakterie roztworami soli np. CaCl2. Chlorek wapnia wykorzystywany w tej metodzie musi być zimny i sterylny, natomiast OD600 (gęstość optyczna hodowli przy długości fali 600 nanometrów) hodowli bakterii musi wynosić 0,2-0,4 (odpowiada to logarytmicznej fazie wzrostu bakterii). Po zwiększeniu kompetencji bakterie mogą być przechowywane w lodówce przez 2-3 dni, lub w temperaturze -80 stopni Celsjusza przez 2-3 miesiące.

Tak przygotowane bakterie transformowano plazmidowym DNA za pomocą metody heat shock. Kompetentne bakterie rozmrożono w lodzie. Dodano do nich mieszaninę ligacyjną i umieszczono na minutę w temperaturze 42 stopni Celsjusza a następnie ponownie umieszczono w lodzie. Do bakterii dodano pożywkę SOC i inkubowano w 37 stopniach przez 45 minut. Następnie bakterie wysiano na szalki z agarem i antybiotykiem selekcyjnym (ampicyliną). Bakterie hodowano na szalkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Z pojedynczych hodowli założono płynne mini hodowle, z których wyizolowano plazmidowe DNA metodą MiniPrep. DNA przygotowano do sekwencjonowania i zsekwencjonowano.

III. Badanie morfologii komórek i kształtu kolców dendrytycznych in vivo

Badania tkanek rozpoczęto od przeprowadzenia perfuzji, czyli procedury polegającej na wprowadzeniu do krwioobiegu myszy paraformaldehydu, co ma na celu utrwalenie tkanek, dzięki czemu pobranie oraz późniejsze krojenie mózgu na skrawki jest łatwiejsze, a ryzyko uszkodzenia tkanki mniejsze. Poza tym, podczas perfuzji krew jest wypłukiwana za pomocą PBS, przez co jej autofluorescencja nie jest widoczna podczas oglądania skrawków mózgu pod mikroskopem konfokalnym. Po perfuzji mózg myszy pobrano i zanurzono na 15 minut w paraformaldehydzie (tzw. Post-fix) a następnie umieszczono w PBS.

W ten sposób mózg przygotowano do kolejnego etapu, czyli krojenia na wibratomie. Po wyjęciu z PBS-u został on przyklejony specjalnym klejem do podstawki i ustabilizowany za pomocą agarozy. Następnie mózg pocięto na skrawki o grubości 100 um, które po zebraniu za pomocą pędzelka umieszczono w buforze PBS w dołkach płytki 24-dołkowej, w oczekiwaniu na kolejne etapy: barwienie DiI oraz immunohistochemię.

DiI to lipofilny barwnik fluorescencyjny, wykorzystywany do wizualizacji elementów morfologii komórek, takich jak chociażby kolce dendrytyczne. Z łatwością dyfunduje on do błony komórkowej neuronów, znakując rozgałęzienia i strukturę kolców. Metoda ta uwidacznia strukturę neuronów lepiej niż stosowane tradycyjnie barwienie Golgiego. DiI jest wprowadzany do komórek z zastosowaniem metody balistycznej.

Przygotowano naboje do GeneGuna, składające się z wolframowych kulek o średnicy 1,3 um, będących nośnikiem dla DiI. Zawiesinę kulek z DiI oraz chlorkiem metylu wprowadzono do plastikowej rurki, którą po wysuszeniu pocięto na około centymetrowej długości odcinki, które wykorzystano jako naboje. Związany z wolframowymi kulkami barwnik wystrzelono za pomocą sprężonego azotu w stronę skrawka. Tak przygotowane skrawki mózgu można oglądać pod mikroskopem bezpośrednio, lub też po dodatkowym barwieniu immunohistochemicznym. Procedura tego barwienia tylko kilkoma szczegółami różni się od barwienia hodowli komórkowych: skrawków „strzelanych” nie traktuje się tritonem w celu permeabilizacji błon (DiI znajdujący się w błonach mógłby się wtedy rozdysocjować), niepotrzebne jest też utrwalanie komórek, gdyż zostało to zrobione podczas perfuzji. Również większa spoistość tkanki w porównaniu z hodowlą komórkową powoduje, że czas inkubacji z przeciwciałem (w tym wypadku wykorzystaliśmy przeciwciała pierwszorzędowe GFP oraz NeuN, oraz drugorzędowe Alexa Fluor 488 oraz 555) musi być dłuższy niż w przypadku kultury komórkowej.

IV. Izolacja białka z mózgu dorosłego szczura

Kolejnym wykonywanym podczas praktyk badaniem była izolacja białka z mózgu dorosłego szczura. Wyizolowano mózg, (tym razem bez uprzedniej perfuzji), po czym rozdzielono go na poszczególne struktury (hipokamp, kora przedczołowa, móżdżek) Do tkanki dodano przygotowany uprzednio bufor do lizy. Tkankę zhomogenizowano i zamrożono. Następnie przygotowano serię rozcieńczeń BSA (bovine serum albumin), które posłużyły do wykreślenia krzywej wzorcowej, za pomocą której obliczono stężenia białka w poszczególnych próbkach metodą Bradforda.

V. Badanie aktywności proteolitycznej białka MMP9 z zastosowaniem zymografii

Zymografia jest techniką służącą do wykrywania właściwości proteolitycznych białek, a dokładniej ich zdolność do rozkładu będącej składnikiem żelu do elektroforezy żelatyny. Materiałem do badań były białka wyizolowane z mózgu szczura. Białka rozdzielano na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem żelatyny. Następnie żele płukano w buforze wywołującym i barwiono błękitem Coomassie, co pozwalało na uwidocznienie miejsc, w których żelatyna została rozłożona przez proteazy (jasne prążki). 

Ciekawostka: sprawdziła się stara prawda, że autokorekta Worda jest jak prymuska z gimnazjum, która myśli, że wie wszystko najlepiej. Gdy pisałem tekst, usiłowała zmienić shRNA na "sarna", NeuN na "neon" i "ligacja" na "libacja" - choć akurat "libacja z wektorem przez noc w temperaturze 16 stopni" jest zdaniem niemal sensownym.