Sprawozdanie z praktyk

Oto tekst sprawozdania, jakie napisałem pod koniec moich praktyk w warszawskim Instytucie Nenckiego. Wybaczcie styl - musiało być w miarę zwięźle i syntetycznie, więc wyszło jak wyszło, ale mam nadzieję, że przybliży to chociaż trochę to, czym zajmowałem się przez blisko dwa miesiące.

Praktyki – wykonane badania:

I. Hodowle pierwotne komórek hipokampa:

Hodowle zakładano z komórek hipokampa pozyskanych od osiemnastodniowych zarodków mysich oraz szczurzych, zgodnie z procedurą opisaną w pracy Culturing hippocampal neurons Bankera. Izolowano mózgi, a następnie hipokampy. Komórki dysocjowano i umieszczono na uprzednio przygotowanych (wyczyszczonych w kwasie azotowym, wysterylizowanych i pokrytych polilizyną) szkiełkach umieszczonych w dołkach płytki 12-dołkowej. Była to hodowla o niskiej gęstości (pomiędzy 50-100 komórek na mm2; większa gęstość mogłaby spowodować tworzenie się agregatów).

W 7 dniu hodowli komórki transfekowano plazmidami kodującymi białko zielonej lub czerwonej fluorescencji (odpowiednio GFP i RFP). Po 24 godzinach komórki utrwalono 4% paraformaldehydem i barwiono metodami immunocytochemicznymi w celu wykrycia markerów komórkowych, takich jak MAP2 (białko cytoszkieletu, występuje w dendrytach), NeuN (białko jądrowe, marker neuronów) oraz synaptofizyna (białko pęcherzyków synaptycznych, marker synaps). Jako przeciwciał drugorzędowych używano między innymi Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555 oraz Texas Red. Następnie komórki oglądano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz konfokalnego, obserwując morfologię komórek.

II. Przygotowanie plazmidu z TIMP1-shRNA:

Przygotowano plazmid kodujący sekwencję shRNA wyciszającą na poziomie ekspresji gen TIMP-1.

Przygotowanie plazmidu obejmowało wklonowanie fragmentu kodującego shRNA do wektora plazmidowego. Następnie wektor namnażano w bakteriach i sekwencjonowano w celu weryfikacji sekwencji wstawki. Szczegółową procedurę opisano poniżej.

Oligonukleotydy z sekwencjami shRNA poddano początkowo procesowi annealingu – po 2 ul każdego z nich dodano do buforu do elucji i umieszczono na ok. 10 minut w temperaturze 99 stopni Celsjusza a następnie schłodzono do temperatury pokojowej, co miało na celu hybrydyzację fragmentów. Następnie poddano je fosforylacji za pomocą ATP oraz kinazy polinukleotydowej oraz ligacji z wektorem (przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza).

W celu dokonania transformacji bakterii należy zwiększyć ich kompetencję, tzn. zdolność do przyjęcia obcego DNA (przepuszczalność błony komórkowej). Można to zrobić, traktując bakterie roztworami soli np. CaCl2. Chlorek wapnia wykorzystywany w tej metodzie musi być zimny i sterylny, natomiast OD600 (gęstość optyczna hodowli przy długości fali 600 nanometrów) hodowli bakterii musi wynosić 0,2-0,4 (odpowiada to logarytmicznej fazie wzrostu bakterii). Po zwiększeniu kompetencji bakterie mogą być przechowywane w lodówce przez 2-3 dni, lub w temperaturze -80 stopni Celsjusza przez 2-3 miesiące.

Tak przygotowane bakterie transformowano plazmidowym DNA za pomocą metody heat shock. Kompetentne bakterie rozmrożono w lodzie. Dodano do nich mieszaninę ligacyjną i umieszczono na minutę w temperaturze 42 stopni Celsjusza a następnie ponownie umieszczono w lodzie. Do bakterii dodano pożywkę SOC i inkubowano w 37 stopniach przez 45 minut. Następnie bakterie wysiano na szalki z agarem i antybiotykiem selekcyjnym (ampicyliną). Bakterie hodowano na szalkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Z pojedynczych hodowli założono płynne mini hodowle, z których wyizolowano plazmidowe DNA metodą MiniPrep. DNA przygotowano do sekwencjonowania i zsekwencjonowano.

III. Badanie morfologii komórek i kształtu kolców dendrytycznych in vivo

Badania tkanek rozpoczęto od przeprowadzenia perfuzji, czyli procedury polegającej na wprowadzeniu do krwioobiegu myszy paraformaldehydu, co ma na celu utrwalenie tkanek, dzięki czemu pobranie oraz późniejsze krojenie mózgu na skrawki jest łatwiejsze, a ryzyko uszkodzenia tkanki mniejsze. Poza tym, podczas perfuzji krew jest wypłukiwana za pomocą PBS, przez co jej autofluorescencja nie jest widoczna podczas oglądania skrawków mózgu pod mikroskopem konfokalnym. Po perfuzji mózg myszy pobrano i zanurzono na 15 minut w paraformaldehydzie (tzw. Post-fix) a następnie umieszczono w PBS.

W ten sposób mózg przygotowano do kolejnego etapu, czyli krojenia na wibratomie. Po wyjęciu z PBS-u został on przyklejony specjalnym klejem do podstawki i ustabilizowany za pomocą agarozy. Następnie mózg pocięto na skrawki o grubości 100 um, które po zebraniu za pomocą pędzelka umieszczono w buforze PBS w dołkach płytki 24-dołkowej, w oczekiwaniu na kolejne etapy: barwienie DiI oraz immunohistochemię.

DiI to lipofilny barwnik fluorescencyjny, wykorzystywany do wizualizacji elementów morfologii komórek, takich jak chociażby kolce dendrytyczne. Z łatwością dyfunduje on do błony komórkowej neuronów, znakując rozgałęzienia i strukturę kolców. Metoda ta uwidacznia strukturę neuronów lepiej niż stosowane tradycyjnie barwienie Golgiego. DiI jest wprowadzany do komórek z zastosowaniem metody balistycznej.

Przygotowano naboje do GeneGuna, składające się z wolframowych kulek o średnicy 1,3 um, będących nośnikiem dla DiI. Zawiesinę kulek z DiI oraz chlorkiem metylu wprowadzono do plastikowej rurki, którą po wysuszeniu pocięto na około centymetrowej długości odcinki, które wykorzystano jako naboje. Związany z wolframowymi kulkami barwnik wystrzelono za pomocą sprężonego azotu w stronę skrawka. Tak przygotowane skrawki mózgu można oglądać pod mikroskopem bezpośrednio, lub też po dodatkowym barwieniu immunohistochemicznym. Procedura tego barwienia tylko kilkoma szczegółami różni się od barwienia hodowli komórkowych: skrawków „strzelanych” nie traktuje się tritonem w celu permeabilizacji błon (DiI znajdujący się w błonach mógłby się wtedy rozdysocjować), niepotrzebne jest też utrwalanie komórek, gdyż zostało to zrobione podczas perfuzji. Również większa spoistość tkanki w porównaniu z hodowlą komórkową powoduje, że czas inkubacji z przeciwciałem (w tym wypadku wykorzystaliśmy przeciwciała pierwszorzędowe GFP oraz NeuN, oraz drugorzędowe Alexa Fluor 488 oraz 555) musi być dłuższy niż w przypadku kultury komórkowej.

IV. Izolacja białka z mózgu dorosłego szczura

Kolejnym wykonywanym podczas praktyk badaniem była izolacja białka z mózgu dorosłego szczura. Wyizolowano mózg, (tym razem bez uprzedniej perfuzji), po czym rozdzielono go na poszczególne struktury (hipokamp, kora przedczołowa, móżdżek) Do tkanki dodano przygotowany uprzednio bufor do lizy. Tkankę zhomogenizowano i zamrożono. Następnie przygotowano serię rozcieńczeń BSA (bovine serum albumin), które posłużyły do wykreślenia krzywej wzorcowej, za pomocą której obliczono stężenia białka w poszczególnych próbkach metodą Bradforda.

V. Badanie aktywności proteolitycznej białka MMP9 z zastosowaniem zymografii

Zymografia jest techniką służącą do wykrywania właściwości proteolitycznych białek, a dokładniej ich zdolność do rozkładu będącej składnikiem żelu do elektroforezy żelatyny. Materiałem do badań były białka wyizolowane z mózgu szczura. Białka rozdzielano na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem żelatyny. Następnie żele płukano w buforze wywołującym i barwiono błękitem Coomassie, co pozwalało na uwidocznienie miejsc, w których żelatyna została rozłożona przez proteazy (jasne prążki). 

Ciekawostka: sprawdziła się stara prawda, że autokorekta Worda jest jak prymuska z gimnazjum, która myśli, że wie wszystko najlepiej. Gdy pisałem tekst, usiłowała zmienić shRNA na "sarna", NeuN na "neon" i "ligacja" na "libacja" - choć akurat "libacja z wektorem przez noc w temperaturze 16 stopni" jest zdaniem niemal sensownym.

Krótki przerywnik

http://www.radioszczecin.pl/index.php?idp=1&idx=88404&idf=168583

Artykuł co prawda sprzed jakiegoś czasu, ale można sobie obejrzeć zdjęcia laboratorium, w którym już od października ekipa naszego bloga będzie zdobywać kolejne doświadczenia. Jak to określił swego czasu jeden z naszych wykładowców, będziemy w końcu pipetować jak biali ludzie. Czego życzymy wszystkim niestrudzonym naukowcom ;)

Znaczenie głupoty w badaniach naukowych

Od tłumacza: poniższy tekst jest tłumaczeniem artykułu Martina A. Schwartza z Wydziału Mikrobiologii na Uniwersytecie Virginia, zatytułowanego The importance of stupidity in scientific research. Wersję angielską eseju można przeczytać tutaj.

Znaczenie głupoty w badaniach naukowych.

Spotkałem niedawno moją starą przyjaciółkę, której nie widziałem już od kilku lat. Oboje byliśmy doktorantami w tym samym czasie, oboje zajmowaliśmy się naukami ścisłymi, choć różnymi ich obszarami. Po jakimś czasie rzuciła ona uczelnię, poszła na wydział prawa na Harvardzie i została prawnikiem, pracuje dla dużej organizacji zajmującej się ochroną środowiska. W pewnym momencie nasza rozmowa zeszła na temat jej odejścia. Ku memu zdumieniu powiedziała, że głównym powodem był fakt, że czuła się tam głupio. Po kilku latach codziennego czucia się głupio, stwierdziła, że czas wybrać sobie inną ścieżkę kariery.

Zawsze uważałem ją za jedną z bystrzejszych osób, jakie znałem i jej późniejsza kariera potwierdziła moje spostrzeżenia. To co powiedziała, zastanawiało mnie. Ciągle myślałem nad tym, aż w końcu, następnego dnia po rozmowie z nią oświeciło mnie. Nauka sprawia, że ja także czuję się głupio. Po prostu przyzwyczaiłem się do tego, tak bardzo, że, prawdę mówiąc, codziennie szukam nowych możliwości by poczuć się głupio. Nie wiedziałbym, co zrobić bez tego uczucia, uważam nawet, że tak właśnie powinno być. Pozwólcie, że wyjaśnię.

Dla niemal każdego z nas jednym z powodów, dla których lubiliśmy nauki ścisłe na uniwersytecie czy w college'u, był fakt, że byliśmy w nich dobrzy. Nie jest to jedyny powód - fascynacja płynąca ze zrozumienia otaczającego nas świata i emocjonalna potrzeba odkrywania nowych rzeczy również mają tu dużo do powiedzenia. Ale nauki ścisłe na uniwersytecie czy w college'u oznaczają  zaliczanie zajęć, a dobre ich zaliczenie oznacza zaznaczenie dobrych odpowiedzi na testach. Jeśli znamy te odpowiedzi, robimy to dobrze i czujemy się mądrze.

Jednak doktorat, w czasie którego musimy napisać pracę badawczą to całkowicie odmienna rzecz. Dla mnie, było to zniechęcające zadanie. Jak mógłbym sformułować pytania, które doprowadziłyby do znaczących odkryć; zaprojektować i zinterpretować eksperyment, tak, by wnioski były całkowicie przekonujące; przewidzieć trudności i drogę pozwalającą je ominąć, albo, gdy mi się to nie uda, rozwiązać je gdy tylko wystąpią? Moja praca doktorska była dość interdyscyplinarna i przez jakiś czas, gdy tylko napotkałem problem, szedłem z nim do członków rady mojego wydziału, którzy byli ekspertami w wielu dziedzinach, których potrzebowałem. Pamiętam dzień, kiedy Henry Taube (który dostał Nagrodę Nobla dwa lata później) powiedział mi, że nie wie, jak rozwiązać związany z jego dziedziną problem, z którym przyszedłem do niego. Byłem akurat w trakcie trzeciego roku mojego doktoratu i uważałem, że Taube wiedział wszystko około tysiąca razy lepiej niż ja (skromnie licząc). Jeśli on nie znał odpowiedzi, nikt nie mógł jej znać.

To mnie uderzyło: nikt nie mógł jej znać. Właśnie dlatego był to problem badawczy. I jako, że był to problem badawczy, moim zadaniem było go rozwiązać. Gdy tylko zrozumiałem ten fakt, znalazłem rozwiązanie w ciągu kilku dni (tak naprawdę nie był zbyt trudny; musiałem tylko sprawdzić kilka rzeczy). Ważną dla mnie lekcją było zrozumienie, że ilość rzeczy, których nie wiem, nie była zbyt duża - dla celów praktycznych możemy przyjąć, że była nieskończona. Uświadomienie sobie tego nie było zniechęcające, było dla mnie wyzwoleniem. Jeśli nasza niewiedza jest nieskończona, jedynym możliwym sposobem działania jest radzenie sobie z tym najlepiej jak tylko możemy.

Chciałbym zauważyć, że nasze tematy prac doktorskich często krzywdzą studentów w dwojaki sposób. Po pierwsze, nie wydaje mi się, że studenci są stworzeni do rozumienia, jak ciężkie jest prowadzenie badań. I jak bardzo, bardzo ciężkie jest prowadzenie ważnych badań. Jest to dużo trudniejsze niż zdanie nawet najbardziej wymagających egzaminów. To co sprawia, że jest to takie trudne to fakt, że badania naukowe są skokiem w nieznane. Po prostu nie wiemy, co robimy. Nigdy nie jesteśmy pewni, czy zadajemy właściwe pytanie lub robimy właściwy eksperyment, dopóki nie uzyskamy odpowiedzi lub wyniku. Trzeba przyznać, że nauka jest jeszcze trudniejsza przez konkurencję o granty czy miejsce na łamach najważniejszych czasopism. Ale i bez tego, prowadzenie naprawdę ważnych badań jest trudne samo w sobie i zmiana przepisów wydziału, instytucji czy państwa nie zdoła zmniejszyć tej wewnętrznej trudności.

Po drugie, nie staramy się wystarczająco, by nauczyć naszych studentów, jak być produktywnie głupimi - mam na myśli, że jeśli nie czujemy się głupi, oznacza to, że nie staramy się wystarczająco. Nie mówię tu o "względnej głupocie" w sytuacji, gdy jedni studenci w grupie czytają materiały, rozmyślają nad nimi i zaliczają egzaminy perfekcyjnie, podczas gdy inni nie. Nie mówię tu też o bystrych ludziach, którzy być może pracują w zawodzie, który nie odpowiada ich talentom. Nauka jest związana z konfrontacją z naszą "głupotą absolutną" - tym jej rodzajem, który jest egzystencjalnym faktem,  nieodłącznym składnikiem naszych wysiłków na drodze w nieznane. Dobrym sposobem przeprowadzania obron prac magisterskich czy doktorskich jest drążenie tematu przez radę wydziału do momentu, gdy student zaczyna udzielać złych odpowiedzi lub też podda się. Celem takiego sprawdzianu nie jest sprawdzenie, czy student będzie znał odpowiedź na każde pytanie. Jeśli tak, wówczas jest to porażka pytających. Prawdziwym celem jest zidentyfikowanie słabości studenta, częściowo by zobaczyć, gdzie powinien nieco bardziej się starać, a częściowo po ty, by sprawdzić, czy wiedza studenta zawodzi na wystarczająco wysokim poziomie, by uznać go za zdolnego do prowadzenia badań naukowych.

Produktywna głupota oznacza bycie ignorantem z wyboru. Skupianie się na ważnych pytaniach stawia nas w dziwnej sytuacji bycia głupim. Jedną z pięknych stron nauki jest, że pozwala nam na błądzenie, bycie w błędzie raz za razem i wspaniałe uczucie, gdy zrozumiemy, że za każdym razem nauczyliśmy się czegoś nowego. Bez wątpienia, może to być trudne dla studentów przyzwyczajonych do uzyskiwania dobrych odpowiedzi. Bez wątpienia, rozsądny poziom pewności siebie i odporności psychicznej pomaga, lecz  uważam, że naukowa edukacja może bardzo złagodzić tę nagłą zmianę: z uczenia się, co odkryli inni, do odkrywania nowych rzeczy samemu. Im bardziej komfortowo będziemy się czuć z byciem głupim, tym głębiej zanurzymy się w nieznane i tym bardziej prawdopodobne, że dokonamy kiedyś nowych odkryć.

Kolorowe obrazki

Zapewne każdy pracownik laboratoryjny spytany którą część swojej pracy lubi najbardziej, wspomni o ostatnim etapie wielu eksperymentów: oglądaniu rezultatów swoich działań pod mikroskopem. Dobrej jakości mikroskop konfokalny w połączeniu z odpowiednio dobranym zestawem przeciwciał potrafią stworzyć prawdziwe dzieła sztuki - przykładem mogą być chociażby zdjęcia wykonane w ramach projektu Brainbow, w którym każdy neuron jest wybarwiany na inny kolor.

Ja również miałem niedawno okazję porobić nieco zdjęć za pomocą mikroskopu konfokalnego - nie był to co prawda eksperyment na miarę nagrody Nobla, ot, ustalenie, które z przeciwciał w laboratorium, w którym odbywam praktyki działa, a które przeniosło się już do immunologicznego odpowiednika Krainy Wiecznych Łowów. Oto co ciekawsze rezultaty:

Zakręt zębaty hipokampu szczurzego przy powiększeniu 10x. W górnej części zdjęcia widoczna jest również kora mózgowa. Przeciwciałem pierwszorzędowym było tutaj (pożyczone - nasze nie działało) MAP2 - uwidacznia ono cytoszkielet komórki. Przeciwciałem drugorzędowym była zielona Alexa Fluor 488. Do uwidocznienia jąder komórkowych zastosowano DAPI (niebieski). Na fotce widać nieco artefaktów - spowodowane jest to zapewne tym, że piszący te słowa ma dwie lewe ręce, gdy przychodzi do nakładania skrawków na szkiełko...

Ten sam skrawek przy powiększeniu 20x. Uwidocznienie tubuliny przez MAP2 pozwala dostrzec aksony komórek nerwowych.

Inny skrawek, wybarwiony za pomocą markera neuronalnego NeuN oraz przeciwciała drugorzędowego Alexa Fluor 555 (jeden z pozostałych skrawków wybarwiłem za pomocą Texas Red, jednak to przeciwciało nie działało tak jak należy). DAPI jest dość słabo widoczne, a w dodatku kompresja pogorszyła jakość zdjęcia, ale można dostrzec, że w większości wypadków niebieskie jądra pokrywają się z czerwonym ciałem komórki.

I na koniec coś znacznie ciekawszego: 

W tym wypadku polecam jednak pobrać pełną wersję i rozkoszować się widokiem całej półkuli szczurzego mózgu w niewiarygodnym rozmiarze 10240 na 11264 pikseli, gdyż miniatura w ogóle nie oddaje szczegółowości zdjęcia. Kilka ciekawostek technicznych:

• Zdjęcie jest złożeniem obrazów ze 110 pól widzenia mikroskopu (10 w poziomie i 11 w pionie). Złożenie zajęło programowi jakieś 56 minut, a rezultat, zapisany w formacie .czi (możliwy do otwarcia tylko w oprogramowaniu mikroskopu) ważył skromne 220 MB.
• Duży rozmiar zdjęcia spowodował, że komputer o całkiem sporej pamięci RAM uparcie odmawiał przekonwertowania go na TIFF.
• Przekrój odpowiada mniej więcej diagramom 49-51 w atlasie The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates George'a Paxinosa i Charlesa Watsona (absolutny must have każdego, kto zarabia na życie grzebaniem w szczurzym mózgu). Właśnie dzisiaj, w ramach pracy z tym atlasem odnalazłem na tym zdjęciu większość struktur - co oznacza mniej więcej tyle, że nauczyłem się w końcu odróżniać kolor bardziej zielony od mniej zielonego...

Practice makes perfect.

O studiach rzecz prawdziwa...
Powyższy link prowadzi do tekstu bardzo w swej istocie prawdziwego. Warto by każdy przyszły naukowiec wbił sobie podstawową zasadę do głowy - że bez praktyki nie ma nic! Niczego nie będzie!
Dlatego trzeba łapać co się da, gdzie się da - często w formie taniej siły roboczej (nawet naszych wschodnich sąsiadów nie można mieć tak tanio jak studentów).
Czasem trzeba posprzątać myszom czy królikom, czasem pomyć masę szkła laboratoryjnego - czasem coś stłuc - czasem biegać z ankietami, czasem stać i przytakiwać... Ale każdy dzień może nas wplątać w coś ciekawego...
pozdrawiam serdecznie
cz.